導入
フィトケラチン(PC) は、分子量 1.5 ～ 4 kDa のポリペプチドであり、その主鎖にはジペプチド γ-Glu-Cys とそれに続く末端Gly の繰り返しがあり、したがってフィトケラチンの基本構造は (γ-Glu-Cys) nです。 -Gly (n は 2 ～ 11 の間で変化します)。メタロチオネイン (MT) および特定の有機酸とともに、天然キレート剤に分類されます。フィトケラチンは、金属イオン、特にカドミウム(Cd 2+ ) に対する植物の耐性に関与しています。フィトケラチンは 1985 年に浮遊培養細胞から初めて単離されました。
フィトケラチンの合成
フィトケラチンの合成は、一般にフィトケラチンシンターゼ（PCS）と呼ばれる酵素、ガンマ-グルタミルシステインジペプチジルトランスペプチダーゼを使用して行われます。この酵素は、γ-Glu-Cys-Gly 基を提供するグルタチオン(GSH) を使用してフィトケラチンを合成します。この概要の要約を添付します。
PCS γ-Glu-Cys-Gly + (γ-Glu-Cys) n -Gly -----> (γ-Glu-Cys) n+1 -Gly + Gly (GSH) (フィトケラチン)
かなりの量の金属イオンが PCS の立体構造を変化させ、PCS を活性化します。この酵素の発現は、生物がさらされる環境の金属毒性に応じて調節されます。フィトケラチンの合成を誘導する金属は、Cd、Ag、Pb、As、Cu などの重金属です。
PCS は 1999 年に初めて同定され、特徴付けされました。金属イオンの認識はフィトケラチンの C 末端部分で起こり、N 末端部分は触媒ドメインとして機能します。キレート化は、次の図に示すように、システインの硫化物単位と金属イオンの間に形成される結合から発生します。
フィトケラチン (PC) には、細胞の液胞によって認識される認識ドメインがあります。したがって、PC-金属イオン複合体は、フィトケラチンおよびATPに特異的なトランスポーターを使用する能動輸送によって捕捉され、液胞に輸送されます。液胞では、フィトケラチンがアミノ酸に分解され、金属イオンが有機酸に結合します。したがって、フィトケラチンは、過剰な金属イオンと複合体を形成し、空胞隔離に関与することにより、過剰な金属イオンが細胞質内で自由に循環するのを防ぎ、金属イオンに対する耐性に関して不可欠な資産を形成します。
天然水からの植物プランクトン中のフィトケラチンの検出
フィトケラチンを分析するには、次の手順を実行する必要があります:サンプリング、サンプルの濾過、チオールの抽出、チオール基の還元、チオールの誘導体化、HPLC によるチオール誘導体の分析。
- サンプリング
ポリカーボネートボトル(2 ～ 4L) で行い、酸(1 M HCl) で洗浄し、その後 Milli-Q水で少なくとも 3 回すすぐ必要があります。サンプルは天然水の深さ 0.3 m から採取されます。
- サンプルのろ過
圧力(<5psi) による真空濾過が必要であり、これには直径 47mm、孔径 0.8μM のニトロセルロースフィルターが使用されます。次に、これらのフィルター（植物プランクトンを含む）をマイクロチューブに入れます。
- チオールの抽出
抽出は、5mM DTPA (金属によるチオール基の酸化を減少させる) を含む 1.2 mL 0.1M HCl (ペプチドのチオール基を分解できる酵素を変性させる) を (マイクロチューブに) 加え、超音波処理器に入れて行います ( 0℃、5分)、抽出された細胞を遠心分離します(20分、13000g、4℃)。
- チオール基の還元
TCEP は還元試薬として使用され、上清(250 µL) に 25 µL の 20 mM TCEP (200 mM HEPES/5 mM DTPA (pH = 8.2) で調製) を添加すると、次の反応に従って酸化チオールを還元できます。
- チオールの誘導体化
チオールの誘導体化には、DTNP (植物プランクトン中の PC の検出には感度が低い)、OPA (短時間安定)、NPM (ジアステレオマーの形成)、SBD-F、MBrB などのいくつかの試薬を使用できます。
植物プランクトン チオールの誘導体化には SBD-F と MBrB のみが使用されます。この実験では、MBrB (アセトニトリル中 1 mM) を選択し、15分後に MSA (0.1M) を加えて反応を停止し、サンプルを冷蔵(4℃) に置き、光から保護します。