導入
メガヌクレアーゼは、大きな認識部位 (12 ～ 40 塩基対の二本鎖 DNA 配列) を特徴とするエンドヌクレアーゼであり、通常、所定のゲノム内に単一コピーで存在することを意味します。桁違いに言うと、I-SceIメガヌクレアーゼによって認識される 18 塩基対の配列に一度遭遇するには、ヒトゲノムの 20 倍のサイズが必要です。したがって、メガヌクレアーゼは最も特異的な制限酵素であると考えられています。
メガヌクレアーゼの中でも、LAGLIDADG ファミリーのホーミング エンドヌクレアーゼは、過去 15 年間にわたってゲノムの研究および操作に好まれるツールとなってきました。
メガヌクレアーゼは、高度に標的を絞った方法で配列を置換、欠失、または修飾するために使用できる「DNA 分子ハサミ」です。タンパク質工学により認識部位を改変することで、標的配列を改変することができます。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、動物などあらゆる種類のゲノムを改変するために使用され、特に人間の健康（ウイルス遺伝物質の除去または改変された遺伝子の「修復」）およびバイオテクノロジー農業において、イノベーションの幅広い可能性を切り開きます。
メガヌクレアーゼは、古細菌、古細菌、細菌、ファージ、真菌、酵母、藻類、特定の植物など、多くの生物に存在します。それらは、細胞のさまざまな部分（核、ミトコンドリア、葉緑体）で発現する可能性があります。これらの酵素のうち数百種類が確認されています。
2つの主な家族
メガヌクレアーゼは主に、ホーミング エンドヌクレアーゼという用語に分類される 2 つの大きな酵素ファミリー、つまりイントロン エンドヌクレアーゼとインテインによって代表されます。自然界では、これらのタンパク質は可動性の遺伝要素、イントロンまたはインテインによってコードされています。イントロンは、DNA 内の特定の位置に組み込まれ、発現されたメガヌクレアーゼのおかげで、可動要素を含まない相補的対立遺伝子の切断を引き起こすことによって増殖します。グループ I イントロンとインテインの場合、切断は二本鎖 DNA の相同組換え機構の介入により、切断部位での可動要素の複製を誘発します。
メガヌクレアーゼの正確な機能はよくわかっていません。最も広く普及している仮説は、それらをコードする遺伝物質が、宿主の遺伝物質を変化させずに、それ自身の利益のために細胞の二本鎖DNA修復機構を使用して増殖し伝達する寄生要素として機能するというものである。
ゲノム工学ツールとしてのメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは特異性が高く、高い精度をもたらし、他の制限酵素よりも細胞毒性がはるかに低いため、1990 年代に特に有望なゲノム修飾ツールとして同定されました。
それにもかかわらず、メガヌクレアーゼによる遺伝子組換えの達成は、利用可能なレパートリーによって制限されていました。実際、自然界に数百のメガヌクレアーゼが存在し、それぞれのメガヌクレアーゼが認識部位のわずかな違いを許容したとしても、所望の位置で特定の遺伝子を切断できるメガヌクレアーゼが見つかる確率は非常に低いです。したがって、所望の認識部位を備えた新しいメガヌクレアーゼの操作は、すぐにいくつかの研究室の目標となった。最も先進的な研究と応用は、LAGLIDADG ファミリーのホーミング エンドヌクレアーゼに焦点を当てています。
「カスタム」メガヌクレアーゼを作成するには、主に 2 つのタイプのアプローチが導入されています。
- 既存のメガヌクレアーゼのアミノ酸鎖に少数のバリエーションを導入し、天然認識部位の「変異体」上の機能タンパク質を選択することにより、既存のメガヌクレアーゼの特異性を変更します。
- より根本的には、メガヌクレアーゼの自然の大きな多様性において重要な役割を果たす特性の利用、すなわち、異なる酵素のタンパク質ドメインを会合または融合させる可能性である。この方法により、半分がメガヌクレアーゼ A の半分の部位、もう半分がプロテインB の半分の部位で構成される新しい認識部位を備えたキメラ メガヌクレアーゼを設計することが可能になります。 I-Dmol と I のタンパク質ドメインを融合することにより、こうして、2つのキメラメガヌクレアーゼ、E-DrelおよびDmoCreが作成されました。
これら 2 つのアプローチを組み合わせることで、高い効率と特異性を維持しながら、新しい酵素を作成する可能性が高まります。フランスのバイオテクノロジー企業である Cellectis の科学者は、ホモ二量体メガヌクレアーゼ I-CreI およびその他のメガヌクレアーゼ構造からの 20,000 を超えるタンパク質ドメインのコレクションを開発しました。それらを組み合わせて、研究室や産業界向けに測定するために作られた機能的なキメラヘテロ二量体を作ることができます。
