導入
蛍光分光法は、蛍光分析または分光蛍光分析としても知られ、サンプルの蛍光を分析する電磁分光法の一種です。これには、特定の化合物の分子の電子を励起し、より低エネルギーの光、通常は可視光を放出させる光線（通常は紫外線）の使用が含まれますが、必ずしもそうではありません。追加の技術は吸収分光法です。
蛍光の測定に使用されるツールは、蛍光計または蛍光計と呼ばれます。
理論
分子は、エネルギー準位と呼ばれる多くの状態で存在します。 蛍光分光法は主にこれらの電子状態と振動状態に関係します。一般に、研究される種は、対象となる基底状態(最も低いエネルギー状態) と、より高いエネルギーの励起状態を持っています。これらの電子状態にはそれぞれ、さまざまな振動状態があります。
光の光子はエネルギーの小さな「パケット」であり、それぞれのエネルギーはその周波数に比例します。したがって、高周波光子は低周波光子よりも高いエネルギーを持っています。これらは分子によって吸収され、光子のエネルギーからエネルギーを増加させるか、分子によって放出され、光子が分子のエネルギーを外部に輸送します。
蛍光分光法では、種はまず、光子の吸収によって基底状態から電子準位の多くの振動準位の 1 つに励起されます。他の分子との衝突は、励起された電子状態の最低振動レベルに達するまで、励起された分子の振動エネルギーの損失を引き起こします。
その後、分子は基底状態の振動状態の 1 つに緩和され、その過程で光子を放出します。このプロセス中に、光子は異なるエネルギーを取得し、したがって異なる周波数を取得します。蛍光分光法でこれらの周波数を分析することにより、さまざまな振動レベルの構造を決定できます。
通常、サンプルが発する蛍光のさまざまな周波数は、一定の波長に保たれた励起光で測定されます。これを「発光スペクトル」といいます。発光スペクトルは、すべての周波数で放出された蛍光の合計を入射単色光の周波数の関数として記録することによって測定されます。
データ分析
低濃度では、蛍光強度は一般に蛍光団の濃度に比例します。
紫外/可視分光法とは異なり、使用する機器に依存しないスペクトルである「標準」を簡単に取得することはできません。 「実際の」スペクトルを取得するには、多くの要因がスペクトルに影響を及ぼし、歪ませるか、考慮して補正する必要があります。ここでは、さまざまなタイプの歪みを、楽器関連またはサンプル関連として分類します。計測による歪みについて最初に説明します。まず、強度と波長の特性が実験ごとに、また実験ごとに時間の経過とともに変化することを知っておく必要があります。さらに、すべての周波数に対して一定の強度をもつランプはありません。これを修正するには、モノクロメーターまたは励起フィルターの後にビームスプリッターを使用して、光の一部を参照検出器に向けることができます。
さらに、モノクロメーターとフィルターの伝送効率も考慮する必要があります。時間の経過とともに変化することもあります。モノクロメーターの透過効率も波長によって異なります。このため、オプションの基準検出器をモノクロメーターまたは励起フィルターの後に配置する必要がありました。検出器によって捕捉される蛍光の割合もシステムに依存します。さらに、検出器の量子効率 (検出される光子の割合) は、検出器が経年劣化するため、検出器、波長、時間によって異なります。
「標準」スペクトルを取得するためにこれらの計測要素を修正することは疑わしいプロセスであり、厳密に必要な場合にのみ適用されます。これは、たとえば量子効率を測定する場合や、発光強度が最も高くなる波長を探す場合に当てはまります。
上で述べたように、サンプルから歪みが発生します。したがって、サンプルの特定の特性も考慮する必要があります。まず、光分解により蛍光強度が時間の経過とともに減少する可能性があります。光の拡散も考慮する必要があります。この文脈で最も重要な散乱の種類は、レイリー散乱とラマン散乱です。レイリー散乱による光の散乱は入射光と同じ波長で発生しますが、ラマン散乱は散乱光の波長を、通常は長波長側に変更します。ラマン散乱は、励起光によって誘発された仮想電子状態の結果です。この仮想状態から、分子は基本振動状態以外の振動レベルに向かって緩和することができます。蛍光スペクトルでは、水中での励起光の場合と同様に3600cm -1低い波数にピークが現れるなど、励起波数に対する波数の一定の差が常に観察されます。
考慮すべきその他の側面は、再吸収を含むフィルターの内部効果です。再吸収は、別の分子または高分子の一部が、蛍光団が発光する波長で吸収されるときに発生します。この場合、蛍光色素分子によって放出された光子の一部が再び吸収される可能性があります。蛍光色素を含む高濃度の吸収分子により、別の内部効果が発生します。その結果、励起光の強度は溶液全体にわたって一定ではなくなります。したがって、励起光のほんのわずかなパーセンテージのみが、検出システムで見える蛍光色素分子に到達します。フィルター内部の影響により、発光のスペクトルと強度が変化するため、蛍光の発光スペクトルを分析する際には考慮する必要があります。