共焦点レーザー走査顕微鏡– MCBL (英語で CLSM は共焦点レーザー走査顕微鏡) は、「光学セクション」と呼ばれる非常に浅い被写界深度 (約 600 nm) で画像を生成する特性を備えた光学顕微鏡です。対物レンズの焦点面をサンプル内の異なる深さレベルに配置することにより、対象物の 3 次元表現を取得できる一連の画像を生成することができます。
オブジェクトはユーザーによって直接観察されるわけではありません。彼はコンピュータによって再構成された画像を見ます。
共焦点顕微鏡の原理は 1953 年にマービン ミンスキーによって説明されましたが、商用モデルが登場してこの技術が多くの研究室で利用できるようになったのは 1980 年代後半になってからです。共焦点顕微鏡は、材料科学だけでなく生物学でも広く使用されています。
原理と特徴
従来の光学顕微鏡では、画像を鮮明にするには、対象物が光学システムの焦点面内にある必要があります。物体が厚い場合、浮き彫りが大きい場合、またはレンズに対して傾いている場合、画像内では物体の一部だけが鮮明になります (被写界深度に関する記事を参照)。
この問題を解決するには、白色光のビームで表面を照射するのではなく、焦点面に共役な検出器の前にピンホールを配置して表面を走査するレンズによって集光されたレーザー ビームを照射します。対物レンズの焦点面 (共焦点面)。このように、焦点面から来る光子のみがピンホールを通過し、画像の形成に関与するため、「共焦点」（単焦点と同義）という名前が付けられています。
レーザー スキャンは 2 つの直交ミラーを使用して行われます。使用される検出器は光電子増倍管 (PMT) で、サンプル内のレーザーの位置に従って光強度が測定されデジタル化され、デジタル画像が直接取得されます。
コヒーレント光源 (レーザー) の使用と照射野の縮小により、従来の光学顕微鏡(200 nm) で期待されるものよりわずかに優れた横方向解像度 (180 ～ 160 nm) を得ることができます。共焦点顕微鏡では、 Z (深さ) の解像度は 600 nm 程度です。
最も頻繁に使用されるレーザーは次のとおりです。
- アルゴンイオン（波長：457nm、488nm、514nm）
- ヘリウムネオン (543nm)
- ヘリウムネオン (633nm)
サンプルの深さにおける画像の位置決めは、一般に、圧電石英を使用して対物レンズを 200 ～ 300 nm の連続ステップでZ方向に移動させることによって得られます。
その他の関連技術
多光子励起による蛍光顕微鏡
共焦点レーザー走査型顕微鏡と非常によく似た技術で、同じ装置を使用します。浅い被写界深度は、パルスレーザーを使用した多光子励起によって限られた体積のみで蛍光を励起することによって実現されます。この励起は、最適な単一光子励起の倍数に近い波長のいくつかの励起光子の準同時の吸収で構成されます。すべての蛍光が検出器に到達し、ピンホールはなくなります。したがって、多光子共焦点顕微鏡という用語が時々不適切に使用されることもありますが、私たちはもはや共焦点顕微鏡について話すことはできません。非常に多くの場合、アプリケーションはバイフソン顕微鏡法 (2 つの光子による蛍光団の励起) に限定されます。自然な共焦点励起の側面に加えて、この技術は、異なる発光スペクトルを持つ複数の蛍光色素分子を同時に励起するために使用されます。
多焦点多光子励起蛍光顕微鏡（triMscope）
原理は同じですが、レーザービームがいくつかのビームに分割されるため、複数の点を同時にスキャンできます。これにより、画像取得時間が短縮されます。
全反射蛍光顕微鏡
共焦点顕微鏡 (600 nm) よりも優れた被写界深度 (200 nm) を得ることができますが、それはサンプルの底部 (より正確にはサンプルと透明な支持体の界面のレベル) でのみです。
その他のテクニック
- 共焦点回転ディスク顕微鏡 (またはニポー スピニング ディスク)。
- 分光共焦点顕微鏡。
- 蛍光相関分光法