光学顕微鏡について詳しく解説

導入

ベーシックな光学顕微鏡。

光学顕微鏡は、対物レンズと接眼レンズを備えた光学機器で、小さな物体の画像を拡大し (これがその倍率を特徴づけます)、この画像の細部 (およびその分解能) を分離して、人間の目で観察可能。生物学では細胞や組織を観察するために、岩石学では岩石を認識するために、冶金学では金属または合金の構造を調べるために金属組織学で使用されます。

双眼ルーペと混同しないでください。双眼ルーペは、平らで薄いサンプルや反射サンプルを必要とせず、小さな倍率で画像を拡大することで準備なしで自然の部分を観察できますが、粒子を明らかにする肉眼検査に役立つ立体視を維持します。亀裂、亀裂など。

歴史

複合顕微鏡を誰が発明したかを言うのは難しい。オランダの眼鏡技師ハンス・ヤンセンとその息子ザカリアス・ヤンセンが1590年に最初の顕微鏡を作ったとよく言われますが、これは17^世紀半ばのザカリアス・ヤンセン自身の発言に由来しています。ザカリアス・ヤンセンが 1590 年頃に生まれたことが示されていることから、記載された日付はまったくありそうもないことです。

顕微鏡の発明者の称号のもう一つのお気に入りは、ガリレオです。彼は 1609 年に凸レンズと凹レンズからなる顕微鏡であるオッキオリノを開発しました。

Francesco Stelluti による 3 匹のミツバチの絵は、教皇ウルバヌス 8 世 (1623-1644) の印章に描かれており、最初に公開された顕微鏡画像と考えられています。同じくオランダ人のクリスチャン・ホイヘンスは、 17^世紀後半に色収差を補正したシンプルな 2 眼接眼レンズを開発しました。これは顕微鏡の開発において大きな前進となりました。ホイヘンスの接眼レンズは現在も製造されていますが、視野がかなり狭く、その他の小さな問題があります。

一般に、アントニ・ファン・レーウェンフック(1632-1723) は生物学者の注意を顕微鏡の使用に向けさせたと考えられていますが、通常の虫眼鏡は16^世紀までにすでに作られ使用されていました。ファン・レーウェンフックの手製の顕微鏡は、1 枚の強力なレンズで構成されたシンプルで小さな器具でした。それに比べて、マルチレンズシステムの開発は依然として難しく、複合顕微鏡がファン・レーウェンフックの単純な顕微鏡と同等の画質を提供できるようになるまでに、光学開発には 150 年以上かかりました。しかし、多くの主張があるにもかかわらず、ヴァン・レーウンウェンフックは複合顕微鏡の発明者であるとは考えられません。

光学顕微鏡の用途と改良

反射顕微鏡法

従来の顕微鏡を使用する場合、透過型で使用します。つまり、光が観察対象のサンプルを通過します。 「反省しながら」取り組むことも可能です。この場合、サンプルは観察者と同じ側から、正立顕微鏡の場合は上から、金属組織学や結晶学で使用される倒立顕微鏡の場合は下から照明されます。光源によって生成された光は、対物レンズを一度通過し、サンプルに到達し、反射されて観察のために対物レンズを通過します。これには、複数のミラーまたはプリズムのセットが必要です。

反射顕微鏡を使用すると、不透明な物体や透過するには厚すぎる物体を検査することができます。もちろん、白色光で観察した場合には、サンプルの表面に関する情報しか得られません。偏光すると、鉱物や金属の成分の粒子の方向が明らかになります。

典型的な例は、顕微鏡写真と呼ばれる金属部品の観察がこの方法で行われる金属組織学です。上で述べたように、顕微鏡はしばしば反転され、観察される部分が支持プレート（通常は円形の穴が開けられている）上に配置されます。

落射照明

透視照明 ( dia -through)とは異なり、落射照明 ( epi -around) を使用すると、不透明なオブジェクトをカラーで観察でき、より「自然な」レンダリングが可能になります。

このような照明のアイデアは古く、1740年にデカルトがリーベルキュームにインスピレーションを与え、顕微鏡観察のために対物レンズを囲む銀の鏡を作成し、この鏡の焦点が準備をターゲットにして以来です。

明視野顕微鏡

明視野（または「明視野」）光学顕微鏡は、最も単純かつ最も古い顕微鏡技術です。使用される波長(可視スペクトル) により、この顕微鏡の分解能は、最高の光学系を備えたものでは 0.2 μm に制限されます。
照明は白色光の透過によって行われます。つまり、サンプルは下から照明され、上から観察されます。この技術の主な制限は、ほとんどの生体サンプルのコントラストが低いことと、焦点面の外側の物質によって生じるぼやけによる解像度が低いことです。一方、この手法はシンプルであり、サンプルの前処理は最小限で済みます。

サンプルが上から照明される場合、その顕微鏡は「倒立顕微鏡」と呼ばれます。次に、対物レンズはプレパラートの下に配置され、接眼レンズがユーザーにとって「通常の」位置に配置されるように、接眼レンズのチューブが光線をまっすぐにします。

暗視野顕微鏡法

「暗視野顕微鏡」の原理を利用した暗視野顕微鏡は、染色されていない透明なサンプルのコントラストを向上させることができます。
暗視野照明では、注意深く調整された光源を使用して、直接透過する光の量を最小限に抑え、サンプルによって散乱された光のみを収集します。これにより、特に透明なサンプルのコントラストが大幅に向上しますが、必要な設備はほとんどなく、サンプルの準備も簡単です。ただし、この技術は収集される光の強度が低いという欠点があり、依然として解像度限界の影響を受けます。

ラインベルク照明は暗視野照明の一種で、透明なカラーフィルターがコンデンサーの直前に挿入され、多かれ少なかれ斜めの光線が異なる色に着色されます（サンプルが明るい黄色に見える一方で、画像の背景は青になることがあります）。 。解像度の限界は暗視野と同じです。他の色の組み合わせも可能ですが、その効果はかなり変わります。

暗視野顕微鏡は特に新鮮なサンプルに適しており、マイクロシネマトグラフィー(移動する細菌など) が可能です。彼女は色のついた物体（色のついた汚れや部分）には興味がありません。これは特に次の場合に役立ちます。 – 珪藻、放散虫などの平らな生物や規則的な構造を持ち透明な物体の観察 – 糸状構造の観察 (例: 鞭毛、繊維、細菌、特定の結晶など) – 点状または点状の物体の観察非常に細い線状であり、明視野顕微鏡の分離にはそのサイズが制限される可能性があります。これらの物体は非常に明るい点や線の画像を与えます (例:梅毒トレポネーマ、梅毒の病原体)、物体が十分に厚い場合は輪郭がはっきりし、最大の細菌の場合はライム病のボレリア病原体になります)。

斜め照明

斜め（側面）照明を使用すると、画像が立体的に見え、他の方法では見えない側面を強調できます。これが主な利点です。制限は明視野顕微鏡の制限と同じです。

偏光顕微鏡

偏光顕微鏡では、サンプルを通過した後の光の偏光の変化を検出するために、サンプルを偏光子と検光子の間に配置します。この技術は、特に鉱物学において複屈折環境を観察するのに非常に役立ちます。

蛍光顕微鏡検査

特定の化合物が高エネルギーの光源で照射されると、より低いエネルギーで光を放射します。これが蛍光現象です。蛍光顕微鏡では、この放出された光を収集して画像を形成します。

この方法は、今日の生命科学において最も重要です。非常に感度が高く、単離された分子の検出も可能です。さまざまな構造や化合物をマークするために、いくつかの蛍光色素が使用されます。これにより、異なる化合物を蛍光色で区別しながら同時に検出することが可能になります。

位相差顕微鏡

位相コントラストは、屈折率の違いをコントラストの違いとして強調する広く使用されている手法です。 1930 年代にオランダの物理学者フレデリック ゼルニケによって開発されました (彼は 1953 年にノーベル賞を受賞しました)。たとえば、細胞の核は、周囲の細胞質では暗く見えます。コントラストは優れていますが、この技術は厚いオブジェクトには使用できません。非常に多くの場合、小さなオブジェクトの周囲にハローが形成され、細部がかき消される可能性があります。

このシステムは、光の円錐を生成するコンデンサー内の円形リングで構成されています。この円錐は、レンズ内の同様のサイズのリングに重ねられます。各レンズにはリングのサイズが異なるため、レンズを交換するたびにコンデンサーを調整する必要があります。レンズ内のリングには特別な光学特性があります。直接光の強度を低減し、さらに重要なことに、拡散光との干渉を引き起こす人工的な 4 分の 1波長の位相差を生み出し、画像のコントラストを生み出します。

共焦点顕微鏡

共焦点顕微鏡は、通常の明視野顕微鏡とはまったく異なる方法で画像を生成します。解像度は若干向上しますが、最も重要な点は焦点面外の光に邪魔されずに断面像を形成できることです。したがって、3 次元のオブジェクトの非常に鮮明な画像が得られます。共焦点顕微鏡は、蛍光顕微鏡と組み合わせて使用​​されることがよくあります。

倒立スタンド顕微鏡