導入
プラスミドは通常、環状の二本鎖 DNA 要素です。それらは、基本的な細菌ゲノムに加えて、多くの細菌にも見られます。それらの存在は、宿主細胞の生存にアプリオリに必要ではないが、環境資源の利用、環境では利用できない必須元素の合成、または毒に対する耐性など、進化上の利点を提供する機能をコードする遺伝子を保有している場合がある。 。そうでない場合は、プラスミドは細胞リソースの使用により無駄になります。実際、細胞自体のゲノムの複製と発現が部分的に損なわれても、それらは複製され、その遺伝子が発現されます。したがって、プラスミドの存在に対する選択因子が存在しない場合、母細胞の分裂中にプラスミドのコピーを受け取らない娘細胞が集団内で優先されることになる。
細菌に関しては、細菌の維持に有利な環境要因が存在しない場合でも、ほとんどの細菌が野生状態で 1 つ以上のプラスミドを含んでいることに注目します。したがって、集団内でのプラスミドのこの維持 (または安定化) には、他の原理が利用されます。
プラスミドの複製は細胞機構によって行われますが、複製の起点と特定の複製因子はプラスミドに特異的です。したがって、プラスミドのコピー数はプラスミド自体によって定義されます。したがって、単純な安定化システムは、ランダムな分布により分裂後の各娘細胞内でコピー数が見つかるようにコピー数を増やすことから構成されます。実際、細胞がプラスミドのコピーなしで終わる確率は 2 -nです。ここで、n は分裂前のコピー数です。したがって、10 コピー存在するプラスミドは、1024 分割ごとに失われる危険性があります。コピー数が 20 の場合、この確率は100 万分の 1 未満に低下します (細胞内のプラスミドの体積サイズによって確率はさらに低下します)。たとえそれがどれほどまれであっても、この喪失は依然として20個のプラスミドの負荷をサポートしなければならない細胞よりも進化上の利点であることに変わりはありません。
低コピー数プラスミドを宿主とする集団内での安定化には、他のメカニズムが必要です。これらの機構は異なるタイプであり、多くの場合、効率を高めるために同じプラスミド上で組み合わされます。概要は次のとおりです。
マルチマーの分離
プラスミドの異なるコピーは同じ DNA 配列を持っています。したがって、それらは相同組換えを受けて、いくつかのプラスミドのマルチマーを形成する可能性があります。コピー数は複製開始点の数と独立したプラスミドの数に応じて制御されるため、多量体化により娘細胞に分布するユニットの総数が減少し、その結果、プラスミドのコピーのない娘細胞が生成される確率が増加します。
このソリューションは、マルチマーからモノマーへの分解を可能にするリコンビナーゼシステム (または染色体上に存在するそのようなシステムを使用) をコードするプラスミドで構成されます。細菌プラスミド RK2 のparCBAオペロンは、ParAリゾルバーゼ、ParB ヌクレアーゼ、および機能不明のタンパク質ParCの遺伝子を含むそのようなシステムの一例です。
毒解毒システム
これらのシステムは、依存症モジュール、プログラムされた死亡システム、または人種隔離後の殺害システム（または PSK、またはフランス語では使用されない「人種隔離後の」殺害）とも呼ばれます。それらは、グラム陰性菌の多くの低コピー数プラスミド上で同定されています。
プラスミドの同じオペロン内に、毒とその毒に対する解毒剤がコードされています (図 1.A)。解毒剤は ATP 依存性プロテアーゼの活性によってすぐに分解されるため、毒に比べて比較的不安定です。したがって、毒の影響を打ち消すのに十分な濃度に維持する必要があり、それにはプラスミドの存在が必要です。実際、分裂中に娘細胞がプラスミドのコピーを受け取らない場合、細胞質にまだ存在する解毒剤は新たに合成できずに分解されてしまいます。したがって、毒は細胞を殺すように作用する可能性があるため、分離後殺害と呼ばれています（図1.B）。 「依存モジュール」という用語は、細胞が生き残るために解毒剤の「用量」に「依存」しているという事実を指します。
解毒剤は、 hok / sokシステムのように毒メッセンジャー RNA の翻訳を妨げるアンチセンス、または毒タンパク質と複合体を形成することによって毒タンパク質の作用を阻害するタンパク質のいずれかでありえます。一部の例外を除いて、タンパク質間システムには共通の特徴があります。オペロンでは解毒遺伝子が毒遺伝子に先行します。
- タンパク質は小さく、解毒剤のアミノ酸は 70 ～ 85 個、毒剤のアミノ酸は 100 ～ 130 個程度です。
- 解毒剤の発現は毒の発現より強い、
- この毒は非常に低用量で効果があり、
- 解毒剤は毒と強力な複合体を形成し、
- 解毒剤は特定の ATP 依存性細菌プロテアーゼによって分解されます (解毒剤の半減期: 30 ～ 60 分)。毒は安定していますが、
- オペロンの転写は解毒剤または毒解毒複合体によって自己抑制され、
- 二次構造の予測は、解毒剤の N 末端に短い β 鎖が存在し、その解毒剤二量体が特異的な DNA 結合による抑制に関与する β シートを形成していることを示唆しています。
記事の最後にある表に、毒解毒タンパク質システムの例をいくつか示します。
-ccd
このシステムは現在最もよく研究されており、大腸菌の F プラスミド上にあります。 ccdオペロンの 2 つの遺伝子は、解毒剤 CcdA (アミノ酸 72 個) と毒剤 ccdB (アミノ酸 101 個) の 2 つのタンパク質をコードします。 ccdB に耐性のある変異体の単離により、ccdB の標的は DNA スーパーコイルの管理に関与する II 型トポイソメラーゼである DNA ジャイレースであることが示されました。その後、ccdB がジャイレースを毒し、ATP 依存的に DNA に二本鎖切断を引き起こすことも示されました。
ccdB によるジャイレース中毒は SOS システムの誘発を引き起こします。このシステムは、DNA 複製フォークの進行を妨げるあらゆるイベント中に活性化されます。これらのイベントは、DNA切断、チミン二量体、さらには DNA とのタンパク質複合体など、多岐にわたります。 SOS の誘導により、損傷が修復されるまで細胞分裂プロセスがブロックされます。細胞は増殖し続けますが、分裂はしないため、糸状に見えます。
ccdオペロンの自己抑制には、CcdA および ccdB の存在が必要です。 DNA 結合に関与する形式は四量体 (CcdA) 2 -(ccdB) 2 であり、遊離形式は六量体 (CcdA) 2 -(ccdB) 4であり、CcdA量の相対的な減少が抑制を軽減し、したがって DNA 結合を促進することを示唆しています。その合成。 CcdA41 は、CcdA の C 末端の 41 アミノ酸のみを含む欠失であり、抗殺傷特性を保持しながら、自己調節能力を失います。これは、CcdA の N 末端部分がccdオペロンのプロモーターへの結合に関与していることを強く示唆しています。この仮説は、CcdA のアルギニン4 からアラニンへの点突然変異が抑制活性を完全に無効にするという事実によって裏付けられます。
CcdA タンパク質は、Lon に対する親和性が ccdB に対する親和性よりもはるかに低いにもかかわらず、Lon プロテアーゼによって分解されます。このモデルは、「偶然に」遊離型の CcdA が分解するだけで分離後の死を引き起こすか、または CcdA-ccdB 複合体を不安定化させる活発なプロセスが存在することを示唆しています。
–ペム
プラスミドR100 (大腸菌) のpemオペロンは、解毒剤 PemI (アミノ酸 84 個) と毒剤 PemK (アミノ酸 110 個) をコードします。このシステムは R1 プラスミドのparDシステムと同一であり、解毒剤は当時 Kis、毒物は Kid と呼ばれていましたが、以下に詳述する parDE システムとの混同を避けるために最初の名前を使用します。
ccdと同様に、プラスミドの安定化は Lon による解毒剤 PemI の分解によるものであり、解毒剤のみでは弱い抑制が観察される場合でも、完全な自己抑制には毒と解毒剤の両方が必要です。
PemK 毒の標的は DnaB である可能性があります。 DnaB は DNA 複製の開始に関与するヘリカーゼであり、DnaB の過剰産生は PemK の毒性作用を阻害します。 PemK は、たとえ特定の菌株で分離後の殺傷効果が観察されたとしても、細胞分裂の阻害剤として作用すると考えられます。
– byDE
RK2 (RP4 とも呼ばれる) は、60 kb (1 kb = 1,000 塩基対の DNA) の大きなプラスミドです。その宿主スペクトルはグラム陰性菌において非常に幅広く、宿主は大腸菌（腸内細菌）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（植物病原性細菌）、マメ科植物の共生根粒菌、緑膿菌（特に院内感染の原因となるヒト病原体）など多様です。種に応じて、染色体あたり 4 ～ 8 コピー存在します。
parと呼ばれる 3.2 kb の遺伝子座は、RK2 の安定化に関与しています。これには、2 つの異なるオペロンに編成された 5 つの遺伝子が含まれています。最初のオペロン、 parCBA (2.3 kb) は、すでに上で述べたように、多量体分割システムを担当し、2 番目のオペロン、 parDE (0.7 kb) は、ParD が解毒剤 (83 アミノ酸) であり、ParE である分離後の殺害システムです。 、毒（103アミノ酸）。これら 2 つのシステムを組み合わせると、損失率が非常に低くなりますが、安定化に対する 2 つのオペロンの相対的な寄与は大腸菌株と増殖温度によって異なります。
ParE 毒の標的はまだ決定されていませんが、ccdB と同様に、ParE はプラスミドを失った細胞の死滅、複製の阻害、SOS システムの誘導、および糸状細菌の出現を引き起こします。一方では RK2 parDEシステムが機能する宿主の多様性、他方では ParE に耐性のある変異体を見つけるのが難しいことを知っていると、ParE が進化において不可欠で非常に保存された機能に影響を与えていると合理的に考えることができます。おそらくその標的の非常に活性な部位です。
ParE は、 parDの終止コドンの 1 塩基上流で始まる遺伝子によってコードされます。ただし、ParD と ParE のin vivo濃度が不明な場合、ParE の発現は ParD の発現よりもはるかに低く、 parEはオペロンの 2 番目の遺伝子であり、他の遺伝子とは異なり、TTG コドンで始まるため、あまり効果的ではないと推定できます。古典的な ATG コドンで始まる毒。
自己抑制は、ParD または ParD-ParE 複合体によって達成されますが、この抑制における ParE の作用を検出することはできません。しかしながら、ＰａｒＤが溶液中で二量体の形態で見出される場合、 ｒ ＤＥによってプロモーターＰに結合するＰａｒＤ分子が４つ存在する。
ParD の 3D 構造は不明ですが、二次構造の予測は、N 末端の β ストランドと、それに続く短いループで接続された 3 つまたは 4 つの α ヘリックスを含むということに収束します。これらの結果は、円二色性および核磁気共鳴分光法の研究と一致しています。したがって、ParD は、β シート DNA 結合タンパク質のファミリーに加わることになります。
CcdA および PemI と同様に、ParD の相対的な不安定性の原因となる大腸菌プロテアーゼは Lon です。
– mazEFおよびその他の染色体システム
mazEF (またはchpA ) モジュールは、RelA タンパク質をコードする遺伝子の下流のrelオペロンに位置します。以前のものとは異なり、それはプラスミド上ではなく、大腸菌の染色体自体にあります。したがって、プラスミドとは異なり、染色体が「失われた」わけではないため、これは分離後の殺戮システムではありません。その配列は、pem の配列および大腸菌の別の染色体系、 chpBと部分的に相同です。 mazEF （解毒剤である82アミノ酸のMazEと毒である111アミノ酸のMazF）の発現は、アミノ酸が極度に欠乏しているときにRelAによって合成されるグアノシン-3′,5′-ビピロリン酸（ppGpp）によって阻害されます。この場合、MazE は ClpPA プロテアーゼによって分解されるため、MazF は自由にその (未知の) 標的を毒し、細胞死につながります。これにより、欠損細胞の多くが犠牲になり、細菌集団の生存が可能になると考えられています。
このプログラムされた死システムは、リファンピシン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンなどの転写または翻訳を阻害する抗生物質によって誘発される可能性があることも示されています。これは、すぐに説明する phd/doc システムによっても有効になります。
別の染色体系relBEは、大腸菌K12 のゲノムで発見され、大腸菌やその他のグラム陰性菌種のいくつかのプラスミドまたは染色体系、さらにはグラム陽性菌や古細菌の染色体系と相同です。 。現在まで真核生物ではホモログは見つかっていないが、大腸菌のRelEは出芽酵母でも活性であり、RelBがその作用を少なくとも部分的に打ち消すことが示されており、使用した手順ではRelBの発現レベルが比較的低い。 。
また、大腸菌の病原性O157:H7株におけるccdの染色体相同体、大腸菌におけるhok / sokの染色体相同体、または結核菌、コレラ菌またはエルシニア・エンテロコリチカにおけるparDEの染色体相同体も発見した。
–博士/博士
溶原性相では、大腸菌バクテリオファージP1 は低コピー数のプラスミドの形で存在します。これには PSK モジュールphd / docが含まれており、Phd (73 アミノ酸) は不安定な解毒剤、Doc (126 アミノ酸) は安定した毒です。 Phd は、ClpPX プロテアーゼによって分解されます。 Phd はオペロンを自動調節できますが、Doc の存在下でより効果的です。
Doc の標的はまだ不明ですが、タンパク質合成の重要なステップに関与していると考えられます。 mazEFの存在は、 phd / docの分離後の殺傷機能に必要であることが確立されており、Doc が解毒剤 MazE の翻訳阻害を引き起こし、それによって死に至ることを示唆しています。したがって、これら 2 つのメカニズムはカスケードで結合されます。
– 制限の変更
毒解毒剤に似た別のタイプのシステムは、制限修飾 (RM) システムです。通常、外来 DNA (ファージなど) から細菌自身を守るシステムの 1 つは、特定の部位またはその近くで DNA分子を切断する制限酵素の存在です。細菌のゲノムの保護は、DNA 分子をメチル化する修飾酵素によって確保され、制限酵素の作用が妨げられます。
このシステムはプラスミドの安定化にも役立ちます。 「古典的な」毒解毒システムとの基本的な違いは、2 つの酵素が制限酵素を不活化する複合体を形成しないことです。さらに、分離後の殺害効果は、メチラーゼのより急速な分解によるものではなく、それによって毒が放出されることになる。そこで、分割が続く間に 2 つの酵素が段階的に希釈されると、メチル化の効率が十分でなくなり、残った少数の制限酵素が DNA に修復不可能な損傷を引き起こすというモデルが提案されました。