導入
アガロースゲル電気泳動は、分子量に基づいて DNA、RNA、またはタンパク質を分離するために生化学および分子生物学で使用される方法です。
アガロースゲル電気泳動技術は、電場の影響下で負に帯電した核酸の分離に基づいています。この分離はアガロースゲルのマトリックスを通して行われます。サイズが小さい分子はより速く移動し、サイズが大きい分子よりも遠くまで移動します。
アプリケーション
アガロースゲル電気泳動には次のような利点があります。
- 簡単、迅速、そして安価なアガロースゲルの調製
- サンプルの変性なし
- アガロースはポリアクリルアミドゲルよりも硬く、毒性が低い
- さらなる分析のためにサンプルを収集することができます
アガロースゲル
電気泳動では通常、1% w/vゲル (最終体積100 ml あたり 1 g のアガロース) が使用されます。識別ゲルが必要であればあるほど、アガロースの割合が増加します。
アガロース
アガロースは、精製された寒天から作られたポリマーです。さまざまな純度のアガロースがサプライヤーから入手可能です。一般に、泳動後にゲルから DNA を抽出する必要がある場合は、高純度でゆっくりと凝固するアガロースが使用されます。
スタンプ
スタンプの種類も非常に豊富です。最も一般的に使用されるのは、トリス/酢酸/EDTA (TAE)、トリス/ホウ酸/EDTA (TBE)、およびホウ酸ナトリウム (SB) です。
TAE の緩衝能力は最も低いですが、大きな DNA フラグメントの分離は良好です。
SB は比較的新しいもので、5000 塩基対 (5 kb) を超える DNA 断片の分離には効果がありません。ただし、導電率が低いため、より高い電圧 (最大 35 V/cm) の使用が可能になり、泳動時間が大幅に短縮されます。
わずか数塩基対の違いを持つ DNA フラグメントは、3% アガロースゲルと非常に低い伝導率の SB バッファー (1 mMホウ酸リチウム) を使用して分離されます。
準備
2 ～ 5 kb のフラグメントを分離することを目的とした 50 ml ミニゲルの例
- 分離するサンプルの数と量に適した型とコームを準備します。
- タンクを満たすのに十分なバッファー (TAE、TBE) (例: 200 ml) を準備し、ゲル (50 ml) を準備します。
- 三角フラスコに、次の表に従って、分離するフラグメントのサイズに従って決定されるアガロースの量を量ります。
| アガロース濃度 (% (M/V)) | 理想的なサイズ範囲 (kb 単位) |
|---|---|
| 0.3 | 5～60 |
| 0.6 | 1～20 |
| 0.7 | 0.8～10 |
| 0.9 | 0.5～7 |
| 1.2 | 0.4～6 |
| 1.5 | 0.2～3 |
| 2.0 | 0.1～2 |
- したがって、この例では、600 mg のアガロースを 50 ml の緩衝液に溶かす必要があります。最終濃度は 1.2% で、0.6 ～ 6 kb のフラグメントを分離するのに理想的です。
- 三角フラスコを電子レンジまたは沸騰水浴に入れ、時々かき混ぜることにより、アガロースを緩衝液に完全に溶解します。最初は小さなレンズの形で見えていた粒子が完全に消えたとき、アガロースは完全に溶解します。
- かき混ぜて放冷するか、約 50°C (触っても耐えられる温度) のウォーターバスに入れます。必要に応じて、絶えずかき混ぜながら三角フラスコに冷水を流して、より速く冷却します。 PMMA モールドを使用する場合は、アガロースが溶けてしまう可能性があるため、PMMA モールドを使用する場合はアガロースを 60°C 以下に冷却することが特に重要です。
- 必要に応じて、臭化エチジウムを最終濃度 0.5 μg/ml まで添加できます。ただし、臭化エチジウムの代わりに他の特定の顕色剤 (SYBR Green I に類似した蛍光色素であるSYBR Goldなど) をゲルに直接添加することは、電気泳動中の核酸の移動度に影響を与える可能性があるため推奨されません。
- コームを使ってアガロースを型に注ぎ、冷まします。すぐに使用できる冷たい凍結ゲルは、完全に半透明のまだ液体のゲルと比較して、端から見ると不透明な外観によって認識できます。プラスチックフィルムまたは緩衝液（TAE、TBE、またはSB）で包装されたゲルは、蒸発により水分が失われすぎる前に、冷蔵庫で4℃で数日間保存できます。臭化エチジウムを含むゲルを臭化エチジウムを含まない緩衝液中に保管すると、ゲルから現像液が拡散する可能性があります。これにより、ゲル内の臭化エチジウムの分布が不均一になる可能性があり、最終的にはバンドの外観に影響を与える可能性があります（負の電荷をもつ核酸は、正の電荷をもつ現像液の濃度が高くなるとより速く移動します）弱い）。
- 電気泳動を実行する直前に、ゲルをタンクに入れ、ゲルがバッファーで覆われていることを確認します。次に、コームを取り外し、サンプルと標準をロードし、適切な電圧または電流を加えて泳動します。核酸の移動速度は電場に依存します。通常、電圧は 1 cm (電極間の距離) あたり 1 ～ 5 V に設定し、電流の変化を許容します (ゲルの導電率は時間とともに変化するため)。
DNAの暴露
最も広く使用されている現像方法は、臭化エチジウム現像 (BET) です。エチジウムブロマイドは、分子生物学研究室で核酸マーカーとして一般的に使用される挿入剤です。紫外線にさらされると赤オレンジ色の蛍光を発し、DNA に結合すると 20 倍強くなります。この効果は、ベンゼン環の剛化ではなく、環境の疎水性の増加によるものと考えられます。ベンゼン環は塩基対の間に位置していません。
あるいは、 SYBR Green I (二本鎖核酸用) または SYBR Green II (一本鎖核酸も検出するため) を含む浴中でゲルをインキュベートすることもできます。 SYBR Green には、毒性が低く、感度が高いため、より少量の核酸を検出できるという利点があります。
解像度の制限
アガロースゲル電気泳動では、理論的には 50 塩基対から数百万までのサイズの DNA 断片を分離できます。ただし、通常は 100 bp ～ 20 kb のサイズの断片を分離するために使用されます。平均移行時間は 1時間です。
小さな核酸フラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって最もよく分離されます。大きな断片は分離するのがより困難です。一般に、150 bp 未満のフラグメントには高濃度 (3 ～ 4%) のアガロースゲルを使用する必要があります。これは、サイズの違いに応じてさまざまなバンドの分離と分解能が向上するためです。主な欠点は、移行にかかる時間が最大で数日かかることです。これらの問題を克服するには、パルスフィールド電気泳動または逆フィールド電気泳動を実行することが有利です。