意味
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、酵素反応、PCR、およびその生成物の連続測定に基づいた、多くの用途を持つ技術です。
さまざまなリアルタイム PCR デバイスがあります。
各増幅サイクルで、蛍光マーカーを使用して総 DNA またはアンプリコンの量が測定されます。重合反応の完全な反応速度を取得することで、エンドポイントPCR で偏りなく取得するのは非常に困難であった、ターゲット DNA の初期量の絶対定量が可能になります。酵素の観点からは、これら 2 種類の PCR の間に理論的な違いはありません。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に関する総合ページを参照することをお勧めします。 PCR DNA増幅技術の並外れた能力のおかげで、微量の DNA から遺伝子プロファイルを確立することが可能になりました。
なぜサイクル数で定量化するのでしょうか?
リアルタイム PCR とエンドポイント PCR の基本的な違いは、測定可能な反応速度 (バックグラウンドを超える) がすべて定量化されることです。したがって、蛍光データは対数で表すことができるため、指数関数的で測定可能な位相を簡単に識別でき、直線的な外観になります。この部分は「定量可能セグメント」と呼ばれ、初期 DNA の量を計算できるようになります。 
左のグラフ(A):
- 初期 DNA 濃度を減少させた 3 つのサンプル (K、L、および M) の理論的な PCR 反応速度 (毎回 10 倍で考慮) が片対数ベンチマークで表されます。バックグラウンドノイズの測定値、またはその影響を多大に受けた測定値 (測定可能な PCR 反応速度のフェーズ 1 および 2) は表示されていません。
- (1) 各サンプルの定量可能なセグメントの面積 (測定可能な PCR 反応速度のフェーズ 3)。他のフェーズは灰色で表されており、この章では関係ありません。
- (2) 定量化可能なセグメントのそれぞれにより、タイプY = aX + Bの方程式を定義できます。右側の式は、バックグラウンド ノイズのために測定できない部分も含めて、対数変換後の PCR の指数関数的位相をモデル化します。サンプル K、L、M の指数関数的位相は、それぞれ紺色、青緑色、藤色の実線で表されます。傾き「a」は PCR 効率から得られます。各サンプルで同じアンプリコンが検出されるため、これは定数であり、線は平行です。原点「B」の縦軸は、サイクル 0 での DNA の量に対応します。したがって、定量化可能なセグメントをモデル化すると、理論的には初期 DNA の量を直接決定することが可能になります。
- (3) 実際には、実験による測定には常に誤差があり、それがどんなに小さいものであっても、定義上予測不可能であり、確率的現象に応答します。濃度 K、L、M のサンプルが数回増幅された場合、非常に近いとはいえ、同じだけ多くの異なる反応速度が得られます (定量可能なセグメントはそれぞれ赤、ピンク、オレンジで表されます)。これらの各測定により、同じ色の点線で表される新しい直線の方程式を確立することができます。次に、さまざまな y 切片 (B) が測定されます。各サンプルで表される 2 つの直線がこの手法の最大誤差を表すと考えます。したがって、それらの B (EK、EL、および EM) 間の差は、各サンプルの測定の不確かさを表します。この不確実性はかなり大きい。この例では、K よりも集中した L、または L よりも M を測定できれば十分ですが、実際には、それよりはるかに大きい (2 ～ 4 桁) ことがよくあります。
- (4) 測定の不確かさは各サンプルで同一ではないことに注意してください (EK は EL より小さく、それ自体は EM より小さい)。右側の方程式を y 軸またはその平行軸の 1 つに投影すると、初期の DNA 濃度依存の不確実性が得られます。
右のグラフ(B):
- (1) 定量化可能なセグメントから決定された方程式は、たとえ生化学的現実を持たない数学的点が得られたとしても、横軸に外挿することができます。
- (2)実験誤差をモデル化した線 (点線と赤、オレンジ、またはピンク) により、新しい不確実性 EK、EL、および EM を定義できるようになります。これらの不確実性はグラフ (A) よりも大きいですが、互いに同じサイズであることに注意してください。したがって、測定誤差は初期 DNA 濃度とは無関係になりました (3)。
- (4) 右側の方程式を、中央の定量化可能なセグメントと交差する横軸に平行な線上に投影することが可能です。このセグメントを「検出閾値」と呼びます。
- ( 5 ) 「交差」の値)。これらは正の実数の空間上で定義された数学的値であり、正の整数ではありません（ただし、サイクルの一部には実験的現実性はありません）。これらの値は初期 DNA の量に反比例し、測定における不確実性は可能な限り最小限に抑えられます (通常 5% 未満)。
したがって、サイクル数 (CT) の数学的値を使用して定量化すると、信頼できる結果を得ることができますが、直接使用することはできません。 DNA の初期量を取得するには、PCR の効率を知る必要がある新しい数学的変換を実行する必要があります。後者は通常、校正範囲を使用して決定されます。
