導入
プロテインブロット（ウェスタンブロッティングとも呼ばれます）は、生体サンプル（血清またはその他の抽出物または組織ホモジネート）中の特定のタンパク質の検出および同定を可能にする分子生物学の方法です。これは補完的な診断ツールです。
テクニカル
プロテオミクス、分子生物学、免疫蛍光法の進歩から生まれたこの技術は、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を使用して、あらかじめ変性させたタンパク質をその質量に応じて分離します。
これらのタンパク質はゲルから膜 (通常はニトロセルロース) に転写され、そこで目的のタンパク質に特異的な抗体にさらされます。この技術のおかげで、組織内のタンパク質の存在を検出し、そのサイズ、濃度、濃度の変動を評価し、異なるグループ間の濃度を比較することが可能になります。抗体を使用する他の技術では、固定後の細胞内 (免疫細胞化学) および組織内 (免疫組織化学) のタンパク質の検出が可能です。
この方法はスタンフォード大学のジョージ・スタークの研究室で開発されました。 Burnette WN. によってこの技術に付けられた「ウェスタンブロット」という名前は、サザンブロット技術の語呂合わせであり、その発明者であるエドウィン・サザンにちなんで命名された DNA 検出技術であり、基本的な点によるものではありません。 RNA の検出はノーザンブロッティングと呼ばれます。これらすべての技術の名前は、ブロッター上の転写（ブロット = 英語で染色）と比較したメンブレン上の転写ステップに由来しています。
診断における医療応用
- 確認的な HIV 検査では、ウェスタンブロット法を使用して血清サンプル中の抗 HIV 抗体を検出します。 HIV に感染していることが知られている細胞からのタンパク質は、上記のように分離され、膜に転写されます。検査対象の血清を塗布します。一次抗体でのインキュベーションステップ。メンブレンをすすぐことによって遊離の抗体が除去され、酵素または発色団に関連する二次ヒトタンパク質に対する抗体が追加されます。標識されたバンドは、患者の血清にどのタンパク質に対する抗体が含まれているかを示します。
- ウェスタンブロットは、 BSE (「狂牛病」として知られる) の確認検査にも使用されます。
- ライム病検出の一部の形式では、ウェスタンブロッティングが使用されます。
西部移転のさまざまな段階
サンプルの準備
サンプル (組織または細胞培養物から) は急速に冷却されるか、さらには冷蔵 (0°C 以下) されます。それらは、超音波処理（膜を破壊するための超音波の使用）、機械的ストレス、または高塩濃度の緩衝液を使用することによって単純に溶解することによって均質化されます。結果として得られるすべての細胞コンパートメントのホモジネートは、そのまま使用することも、細胞質画分、核画分、膜画分を単離するために数段階の分画遠心分離にかけることができます。次に、サンプルは処理されて、それぞれの異なるサンプルから一定レベルのタンパク質が収集されます。これには、ビウレット法またはクマシーブルー法 (ブラッドフォード法) を使用したタンパク質の定量が含まれます。
次にサンプルは、緩衝物質、通常はトリス、色素、スルフヒドリル成分（通常はβ-メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール、より単純にはDTT）、親油性アニオン性物質を含む緩衝液（例：レムリ緩衝液）中で1〜5分間煮沸されます。アルキメデスの推力を高めるための洗剤(ドデシル硫酸ナトリウムまたは SDS)、およびグリセロール。
沸騰させると、分子内の弱い結合が切断されてタンパク質が変性し、タンパク質が完全にほどかれます。次に、SDS はそれらを溶媒和して沈殿を防ぐために負電荷が豊富な環境をそれらに提供し、スルフヒドリル成分がジスルフィド架橋の再生を防ぎます。グリセロールは、ゲルリザーバーの上部の緩衝液と比較してサンプルの密度を増加させ、ゲルコンパートメントの底に沈みやすいサンプルを配置しやすくします。
ゲル電気泳動
サンプル中のタンパク質はゲル電気泳動によってサイズごとに分離されます。その組成は研究室、目的のタンパク質の分子量、および利用可能なバッファーによって異なります。ポリアクリルアミドゲルが最も一般的です。タンパク質はゲルを一次元（上から下）にのみ通過するため、サンプルはゲル内に形成された「ウェル」に隣り合ってロードされます。ウェルの下に形成された各「レーン」では、タンパク質が質量によって「バンド」に分離されます。 1 つのレーンは、市販されている規定の分子量を持つタンパク質の混合物である「マーカー」または「標準スケール」用に予約されています。
単一サンプルからタンパク質を二次元に移動させる2D ゲルを使用することもできます。次に、タンパク質は、1 番目の次元では等電点 (つまり、正味電荷が中性になる pH) によって、 2 番目の次元では重量によって分離されます。
ウエスタンブロッティング用の電気泳動バッファー（ランニングバッファー）の組成は、10 倍に濃縮した TGS バッファー（Tris-glycine-SDS）を 1倍量の蒸留水9 倍に加えたものです。
膜転写
タンパク質を抗体検出に利用できるようにするために、タンパク質はゲルからニトロセルロースまたは PVDF メンブレンに転写されます。メンブレンをゲルと向かい合わせに置き、大きなプレートの両面のうちの一方に電流を流します。荷電したタンパク質は、ゲル内での相対的な組織を保持したまま、ゲルから膜に移動します。この転写の結果、タンパク質は薄い表面に露出し、その後の検出ステップが容易になります。ニトロセルロース膜と PVDF 膜はどちらも「粘着性」があり、タンパク質に非特異的に結合します(つまり、サンプル中に存在するすべてのタンパク質に同じように結合します)。タンパク質の膜への付着は、膜とタンパク質の間の疎水性相互作用およびイオン性相互作用によって起こります。ニトロセルロース膜は PVDF 膜よりも安価ですが、耐久性が低く、何度も使用できません。ニトロセルロース膜とは異なり、PVDF 膜は使用前に 100%メタノールまたはイソプロパノールに浸す必要があります。
一般的な転送バッファー 1リットルの組成は次のとおりです。
- 蒸留水 700ml
- 10倍濃縮したTG（トリスグリシン）緩衝液 100ml
- メタノール 200ml
- SDS 4ml
ブロッキング
膜はその非特異的結合特性に基づいて選択されており、標的タンパク質と抗体は両方ともタンパク質であるため、膜と抗体間の相互作用を最小限に抑えるための予防措置を講じる必要があります。膜と抗体の間の非特異的相互作用部位をブロックするには、膜をタンパク質の希釈溶液 (ほとんどの場合、ウシ血清アルブミン、BSA、または脂肪を含まない牛乳) (100 ml あたり 5% に希釈した牛乳) に浸します。 – 洗剤、通常は Tween® 20) の存在下、室温で 1時間。
希釈溶液中のタンパク質は、標的タンパク質が占有していないすべての部位で膜に結合します。このようにして、抗体が次のステップで適用されるとき、抗体は（理想的には）標的タンパク質の結合部位の膜にのみ結合することができ、最終的なウェスタンブロット生成物の「バックグラウンドノイズ」が減少し、より鮮明な結果が得られます。結果を検出し、誤検知を排除します。
検出
検出中、膜は抗体を使用して目的のタンパク質を「プローブ」され、その後、測光信号または比色信号、または光子を放出する酵素に結合されます。いくつかの理由により、これは通常 2 ステップで行われますが、一部のアプリケーションでは 1 ステップの方法も利用できます。
2 段階の方法
一次抗体
抗体は、動物（通常はウサギまたはヤギ）に接種するか、免疫細胞の培養物を目的のタンパク質全体またはその一部（エピトープ）のみに曝露することによって生成されます。ただし、タンパク質はゲル電気泳動中に変性しているため、天然のタンパク質ではなく、変性したタンパク質を特異的に認識する抗体を使用する必要があります。
この場合、正常な免疫応答は、タンパク質に直接結合する、優れた感度と優れた特異性の両方を備えた検出ツールとして収集および使用される抗体の生成に利用されます。そのため、抗体は「一次」抗体と呼ばれています。モノクローナル抗体の中には、製造がはるかに難しく、親和性がはるかに高いものもありますが、ウェスタンブロッティングでも使用できます。
ブロッキング後、一次抗体の希釈溶液 (通常 0.5 ～ 5 マイクログラム/ml) をメンブレンと適度に振盪しながらインキュベートします。溶液は通常、中性 pH に近い生理食塩水緩衝液 (通常は少量の塩化ナトリウム)、少量の洗剤、および場合によっては希釈タンパク質 (ASB または 5% 牛乳) で構成されます。抗体溶液とメンブレンをビニール袋に密封し、30 分から一晩一緒にインキュベートします。さまざまな温度でインキュベートすることもでき、温度が高いほど、より多くのより特異的な結合が生じます。
二次抗体
メンブレンをすすいで結合していない一次抗体を除去した後、一次抗体の種特異的部分に対する別の抗体にさらします。この抗体は「二次」抗体として知られており、その標的特性により、「抗マウス」、「抗ヤギ」、「抗ウサギ」などと呼ばれる傾向があります。抗体は動物源（ただし通常は異なる種）、または動物起源のハイブリドーマの培養物に由来します。抗マウス抗体は、マウス由来のほぼすべての一次抗体に結合するため、研究室が単一ソースの二次抗体を共有することでコストが節約され、より再現性の高い結果が得られます。二次抗体は通常、ビオチン、またはアルカリホスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなど、膜上の目的のタンパク質を視覚的に識別できる酵素に結合します。このステップには、いくつかの二次抗体が一次抗体に結合し、シグナルを改善できるという利点があります。
最も一般的には、西洋わさびペルオキシダーゼに結合した二次抗体を発光剤と組み合わせて使用し、反応生成物はタンパク質濃度に比例して発光します。感受性の高い写真フィルムをメンブレンに当て、反応による光に曝露すると、メンブレンに結合した抗体の画像が作成されます。現在では、写真フィルムの代わりに CCDカメラが使用されることが多くなりました。
ELISPOT および ELISA 手順と同様に、酵素には基質分子が供給されます。基質分子は酵素によって変換されて、膜上に見える着色された反応生成物を放出します。
3番目の可能性は、二次抗体に結合した酵素ではなく放射性標識を使用することです。たとえば、ブドウ球菌プロテインAなどの抗体結合タンパク質をヨウ素の放射性同位体で標識することです。ただし、他の方法がより安全で、より速く、より安価であるため、この方法は多かれ少なかれ使われなくなりましたが、特定の状況では依然として使用されることがあります。
ワンステップ方式
この技術が登場したとき、一次抗体と二次抗体を 2 つの別々のプロセスで生成するのが比較的容易だったため、検出プロセスは 2 段階で実行されました。これにより、研究者やサプライヤーはある程度の柔軟性を持って使用できるようになり、検出プロセスにシグナル増幅ステップが追加されます。しかし、より低い検出マージンでのハイスループットタンパク質分析、つまり非常に低濃度でのタンパク質の検出の出現以来、時間と原材料を節約できる独自のワンステッププロービングシステムを開発することが魅力的になりました。これらのシステムには、目的のタンパク質を検出し、検出可能なシグナルを発することができる検出抗体が必要です。多くの場合、これらの両方が既知のタンパク質マーカーに利用可能です。一次プローブは、一次抗体と同じ 2 段階プロセスでメンブレンとインキュベートされ、一連の洗浄ステップを経て直接検出の準備が整います。
分析
未結合の二次抗体を洗い流した後、ウェスタンブロットで目的のタンパク質に結合した標識プローブを検出する準備が整います。実際には、ブロット後のゲルにはタンパク質が完全に含まれていないわけではないため、すべてのウェスタンブロットで膜の特定のバンド上のタンパク質が明らかになるわけではありません。サイズの概算は、マークされたバンドを、別のウェルでの電気泳動中にロードされた標準範囲マーカーのバンドと比較することによって行われます。このプロセスは、サンプル間で濃度が変化しないアクチンやチューブリンなどの構造タンパク質に対して繰り返されます (内部対照)。実験を標準化するために、標的タンパク質の濃度は内部対照として機能するタンパク質の濃度にインデックス付けされます。これにより、エラーまたは不完全な転写が発生した場合に、メンブレン上の総タンパク質レベルに関連した補正が可能になります。
比色検出
この方法は、ウェスタンブロットのインキュベーション中に、二次抗体に存在するトリガーに反応する基質 (ペルオキシダーゼなど) の存在に依存します。これにより、可溶性色素が異なる色の不溶性色素に変換され、酵素の隣に沈殿するため、ニトロセルロース膜に色がつきます。次に、可溶性色素を洗い流すことによってウェスタンブロットの展開を停止します。タンパク質濃度は、濃度測定、バンド強度評価、または分光測光法によって評価されます。
化学発光検出
この方法では、ウェスタンブロットのインキュベーション中に、二次抗体上に存在するトリガーにさらされた後に光を発する基質の存在が必要です。放射された光は写真フィルムに焼き付けるために使用され、最近ではウエスタン転写のデジタル画像を復元する CCD カメラによって使用されます。画像は、タンパク質標識の相対率を評価するデンシトメトリーによって分析され、光学濃度の観点から結果を定量化します。ソフトウェアにより、適切な標準を使用した場合の分子量分析などのデータのさらなる分析が可能になります。 「強化化学発光検出」(ECL) と呼ばれるこの方法は、ウェスタンブロット分析で最も感度の高い検出方法の 1 つと考えられています。
オートラジオグラフィー検出
放射性標識には酵素基質は必要ありませんが、医療で使用されるフィルムを X 線イメージングに使用できます。フィルムはウェスタンブロット上に直接配置され、ラベルに曝露されると拡張して暗領域が作成されます。目的のタンパク質のバンド (図を参照)。放射性物質の検出方法の重要性は、そのコストと ECL などのより安全な技術により低下しています。
蛍光検出
抗体に結合したプローブは単色光線によって励起され、その結果生じる発光が光センサー、たとえば適切な透過フィルターを備えた CCD カメラによって検出されます。これにより、ウェスタンブロットのデジタル画像が復元され、次のようなより詳細な分析が可能になります。分子量分析または定量的ウェスタンブロッティング。蛍光は、ウェスタンブロット分析における化学発光とほぼ同等のレベルであると考えられます。ただし、より高価なツールが必要です。
蛍光と化学発光の違い
化学発光と蛍光は同様の光物理学的メカニズムを持っていますが、同じものではありません。
- 蛍光とは、分子が安定状態から励起状態に励起され、分子の特定の波長の 電磁スペクトルにおける放射線の放出によって基底状態に戻ることを指します。
- 化学発光とは、分子が化学反応の生成物として励起状態で形成され、特定の波長の長さの電磁スペクトルで放射線を放出して基底状態に戻る状況を指します。
二次調査
ニトロセルロースメンブレンと PVDF メンブレンの最大の違いの 1 つは、抗体の「ストリッピング」と、他の抗体によるプローブのためのメンブレンの再利用をサポートする能力です。ニトロセルロース膜を再利用するための十分に確立されたプロトコルはありますが、厚い PVDF を使用することで、これらの操作を安全かつ簡単に実行でき、パリンプセストのように寄生「ノイズ」がカバーされる前にさらに使用することができます。もう 1 つの重要な違いは、PVDF はニトロセルロースとは異なり、使用前に 95% エタノールまたはイソプロパノールに浸す必要があることです。また、PVDF 膜はより厚く、通常の使用に伴う物理的損傷に対してより耐性がある傾向があります。